La cappella del Tesoro è, con la Sacrestia e la Cappella Carafa, tra gli ambienti più interessanti dell’Annunziata. L’elegante portale di accesso che reca in alto lo stemma dell’antico Banco dell’Ave Gratia Plena (AGP) fu progettato dall’architetto fiorentino Giovanni Antonio Dosio (1533-dopo 1609). Edificata alla fine del Cinquecento dal romano Giovan Battista Cavagna (1545 ca.-1613), presenta al suo interno un paramento in maiolica seicentesca dai vivaci colori che corre lungo la fascia inferiore delle pareti, mentre, in alto, una serie di tredici nicchie ospitavano numerose reliquie provenienti da Lesina, feudo della Santa Casa. Nel 1598 su disegno dello stesso Dosio furono progettate otto nicchie per altrettanti busti reliquiario in argento, contenenti i sacri resti dei martiri. In seguito, a causa di una serie di editti reali emanati da Ferdinando IV di Borbone sul finire del Settecento, che imposero la vendita e la fusione alla Zecca degli oggetti in metallo prezioso, furono sostituiti con altri in legno dorato.

Oltre alle reliquie dei Santi Martiri, la cappella del Tesoro custodiva anche alcuni frammenti della Croce e della corona di spine di Cristo.

Sulle pareti e sulla volta del Tesoro sono dipinte scene riguardanti martirii allusive alle reliquie custodite, affrescate da Belisario Corenzio (1558-1646) e del pittore umbro Avanzino Nucci (1552-1629) fra il 1597 ed il 1599. Restaurati da Lorenzo De Caro (1719-1777) nel Settecento, oggi sono pressoché illeggibili. Nella cappella è il monumento funebre di Alonzo Sanchez, ministro delle Finanze della corte vicereale, eseguito nel 1588 dal fiorentino Michelangelo Naccherino (1550-1622).